SNK6細(xì)胞（人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞）

細(xì)胞接收

1. 凍存細(xì)胞

如果是干冰運輸?shù)膬龃婕?xì)胞，收到后請立即轉(zhuǎn)入液氮儲存保存，或直接進行細(xì)胞復(fù)蘇。

2. 活細(xì)胞

收到后用 75%的酒精對 T25 瓶外表面進行消毒，之后放在 5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置 2 h，靜置后取出細(xì)胞瓶在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況和細(xì)胞匯合度，分別在 100 X 和 40 X 下各拍 2 個不同視野的細(xì)胞拍照記錄。如果匯合度達(dá)到 80%以上的傳代密度，可以進行傳 代操作，如果細(xì)胞匯合度沒有達(dá) 80%以上不夠傳代，棄掉瓶內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮完培養(yǎng)基。(灌滿細(xì)胞培養(yǎng)基不能正常用來培養(yǎng)細(xì)胞)

細(xì)胞復(fù)蘇

1. 水浴鍋 37℃預(yù)熱；

2. 適合該細(xì)胞系的完培養(yǎng)基預(yù)熱到 37℃；

3. 在 15 mL 離心管中加入 6 mL 完培養(yǎng)基備用；

4. 從液氮中取出細(xì)胞，在 37℃水浴中輕輕轉(zhuǎn)動凍存管，直到凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細(xì)胞在 2 min 內(nèi)迅速解凍（水不能沒過蓋子或用封口膜把凍存管口封上）；

5. 將凍存管轉(zhuǎn)移到超凈工作臺內(nèi)；打開蓋子前，用 75％酒精擦拭凍存管外部；

6. 用移液槍吸取細(xì)胞凍存懸液，轉(zhuǎn)移至已預(yù)熱的完培養(yǎng)基的離心管內(nèi)；

7. 細(xì)胞懸液以500 g離心 5 min；

8. 離心后，檢查上清液是否清澈，有無完整的細(xì)胞沉淀；在無菌條件下，小心吸掉上清液，加入 1 mL 完培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻；

9. 將細(xì)胞接種到 1 個 T25 培養(yǎng)瓶或同等底面積的培養(yǎng)容器，每瓶加入 4 mL 完培養(yǎng)基；

10. 搖勻細(xì)胞，放入 37℃、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（培養(yǎng)環(huán)境取決于細(xì)胞和培養(yǎng)基類型）；

11. 復(fù)蘇次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。

(1) 貼壁細(xì)胞若細(xì)胞貼壁情況良好，可以更換新鮮的完培養(yǎng)基；若觀察到細(xì)胞呈圓亮形態(tài) 但不貼壁，可以讓細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后再進行換液操作。之后，根據(jù)細(xì)胞的生長狀況，每 2-3 天更換一次完培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代。若細(xì)胞生長較慢或匯合度較低時，可以減少換液次數(shù)。

(2) 懸浮細(xì)胞復(fù)蘇后盡量放在相對小一些的容器中，使用含 20％血清的培養(yǎng)基復(fù)蘇。懸浮細(xì)胞若細(xì)胞狀態(tài)良好，可以更換新鮮的完培養(yǎng)基；若細(xì)胞狀態(tài)差且呈現(xiàn)灰度，可以繼續(xù) 培養(yǎng) 24 h 后再觀察細(xì)胞。觀察發(fā)現(xiàn)有活細(xì)胞，可進行換液操作，觀察細(xì)胞無明顯變化，及時反饋本公司售后。

細(xì)胞傳代

1. 貼壁細(xì)胞

(1) 將完培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至 37℃；

(2) 從培養(yǎng)容器中吸棄上清；

(3) 從容器一側(cè)輕輕加入 PBS（T25 培養(yǎng)瓶加入約 2 mL）洗滌細(xì)胞 1 次。注意動作輕柔，清洗全面，避免攪動細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次吸去 PBS（注：沖洗步驟可去除可能抑制

解離劑作用的少量血清、鈣和鎂）；

(4) 加入胰酶（T25 培養(yǎng)瓶加入約 1 mL），搖晃均勻，保證充分接觸細(xì)胞表面。放入培養(yǎng)箱消化；

(5) 顯微鏡下觀察消化情況，約 70％～80％細(xì)胞收縮變圓后，輕拍培養(yǎng)容器外壁，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)表面；

(6) 立即加入 2-3 倍胰酶體積的完培養(yǎng)基（T25 培養(yǎng)瓶加入約 3 mL），隨即輕搖培養(yǎng)容器，使培養(yǎng)基和胰酶迅速混勻，終止消化；

(7) 使用移液管吸取細(xì)胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，損傷和損失細(xì)胞。

(8) 收集的所有細(xì)胞懸液以 500 g 離心 5 min；

(9) 離心后去除上清。加入1 mL完培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻；

(10) 將細(xì)胞按一定的比例傳代接種，建議按照 1：2 進行傳代，若細(xì)胞在兩天內(nèi)長滿可增加傳代比例，若細(xì)胞生長三四天還未長滿，可適當(dāng)縮小傳代比例； 注意：請根據(jù)細(xì)胞實際生長情況調(diào)整傳代比例。

(11) 搖勻細(xì)胞，放入 37℃、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋）；

(12) 傳代次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多死細(xì)胞，進行換液操作。之后，每天根據(jù)細(xì)胞的生長情況更換完培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代或凍存。

2. 懸浮細(xì)胞

(1) 將完培養(yǎng)基、PBS、胰酶預(yù)熱至 37℃；

(2) 使用移液管吸取細(xì)胞懸液，吹打培養(yǎng)容器底面數(shù)次，盡可能將細(xì)胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈，避免產(chǎn)生大量氣泡，損傷和損失細(xì)胞。

(3) 收集的所有細(xì)胞懸液以 500 g 離心 4 min；

(4) 離心后去除上清。加入1 mL完培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞沉淀，充分吹散、混勻；

(5) 將細(xì)胞按一定的比例傳代接種，建議按照 1：2 進行傳代，若細(xì)胞在兩天內(nèi)長滿可增加傳代比例，若細(xì)胞生長三四天還未長滿，可適當(dāng)縮小傳代比例；

注意：請根據(jù)細(xì)胞實際生長情況調(diào)整傳代比例。

(6) 搖勻細(xì)胞，放入 37℃、5％CO2 的培養(yǎng)箱中（如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶

蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋）；

(7) 傳代次日，觀察細(xì)胞狀態(tài)。若發(fā)現(xiàn)較多死細(xì)胞，進行換液操作。之后，每天根據(jù)細(xì)胞的生長情況更換完培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代或凍存。

細(xì)胞凍存

1. 按細(xì)胞傳代的方法，收集細(xì)胞沉淀，根據(jù)沉淀大小加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

2. 用移液管吹打混合均勻，取 20 μL 進行細(xì)胞計數(shù)；

3. 500 g 室溫離心 5 min，離心后，打開蓋子吸去上清，用 1~2 mL 4℃預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，隨后

4. 加入凍存液調(diào)整至密度為 1x10⁶-1x10⁷ 個細(xì)胞/mL；

5. 將細(xì)胞懸液按 1 mL/管平均分裝至凍存管中，旋緊蓋子，凍存管應(yīng)提前貼好細(xì)胞名稱、細(xì)胞代次、數(shù)量、凍存日期；

6. 將凍存管放置于 4℃預(yù)冷的程序降溫盒中，并在凍存結(jié)束的 15 分鐘之內(nèi)將程序降溫盒放置超低溫冰箱內(nèi)；

7. 過夜后，將凍存細(xì)胞轉(zhuǎn)移至液氮罐內(nèi)保存。

! 注意事項

1. 收到常溫細(xì)胞后，及時拍照記錄有無漏液/瓶身破損現(xiàn)象。

2. 用 75%酒精擦拭細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。先不要打開培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng) 2~4 小時，以便穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

3. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如貼壁特性、細(xì)胞形態(tài)、所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、傳代比例、換液頻率等。

4. 靜置完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡檢、拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)（所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù)）；建議細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照，記錄細(xì)胞生長狀態(tài)。

5. 若觀察到異常或?qū)?xì)胞有疑問，請及時跟我們聯(lián)系；對于細(xì)胞培養(yǎng)操作及培養(yǎng)注意事項有疑問的，可跟我們的技術(shù)支持交流。

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